本发明公开了一种新型骨化二醇（25‑羟基维生素D 3 ）分离纯化方法，主要包括以下步骤：利用有机溶剂对骨化二醇进行萃取分离，萃取液浓缩，重溶，制备骨化二醇的上柱原液，利用凝胶层析柱，初步纯化骨化二醇产品，进一步利用大孔吸附树脂对骨化二醇产品进行纯化分离，最后结合硅胶柱层析纯化，制备高纯度骨化二醇产品，上柱洗脱液经浓缩，结晶，得到骨化二醇结晶产品。本发明具备以下优点：1、利用该工艺分离纯化的骨化二醇产品纯度高，收率高。2、本专利首次将凝胶柱层析及大孔树脂吸附层析应用于骨化二醇产品的分离纯化中。3、该分离纯化工艺简单，操作方便，可以进行多次循环操作，设备成本低，极利于工业化推广。4、本工艺中采用的有机溶剂均可回收重复利用，降低生产成本，经济环保。

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