本发明公开了一种从补骨脂中分离补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚的方法，包括如下步骤：a)将补骨脂药材经粉碎后用石油醚提取，得补骨脂的石油醚粗提物；b)将补骨脂的石油醚粗提物上聚酰胺柱，以乙醇与水的混合溶液进行梯度洗脱，收集目标流份，减压浓缩，得到补骨脂酚以及补骨脂素与异补骨脂素的混合物；c)将补骨脂素与异补骨脂素的混合物上硅胶柱，用石油醚与乙酸乙酯的混合溶液进行洗脱，收集目标流份，减压浓缩，即得补骨脂素和异补骨脂素。本发明实现了补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚的同时大量分离，且纯度均高于99％，解决了补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚同时分离的难题。

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